|
|
|
|


 企业新闻 NEWS 你当前的位置:首页>> 企业新闻


IHC(P) 免疫组化石蜡切片操作规程
点击次数:502 发布时间:2017-07-18
 

IHC(P) 免疫组化石蜡切片操作规程

(一)、仪器设备
    1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;
    2)水浴锅

(二)、试剂 
    1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
    2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。
    3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
    4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 
    5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
    6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
    7)封裱剂:
    a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合; 
    b、油和TBS(或PBS)配制。  
    8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。 

(三)、操作流程 
    1、脱蜡和水化 
    脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 
    1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;
    2)无水乙醇中浸泡5分钟;
    3)95%乙醇中浸泡5分钟; 
    4)70%乙醇中浸泡5分钟; 
    2、抗原修复
   用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
   1)抗原热修复
   (1)高压热修复 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
   (2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。
   (3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。 
   2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。

抗原修复注意事项:

1)载玻片的处理:
    抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常进行,可选用PES、Poly-L-Lysine等试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下:
1.1 APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。
1.2 Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2)常用酶消化:
2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37℃、10~40分钟,主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为0.4%,消化时间为37℃、30~180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白),Collagen IV(IV型胶原)等。
2.3 皂素(Saponin):一般使用浓度为2~10?g/ml的saponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。
3)抗原热修复:
可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中,混匀,其pH值在6.0 ± 0.1,如因蒸馏水本身造成的pH值偏差,请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器,室温冷却10~20分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后),计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS洗2分钟×3,下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。

    3、免疫组织化学染色 
    SP法
    1)脱蜡、水化;
    2)PBS洗2~3次各5分钟;
    3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟;
    4)PBS洗2~3次各5分钟; 
    5)抗原修复;
    6)PBS洗2~3次各5分钟;
    7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
    8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
    9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
    10)PBS洗3次各5分钟;
    11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;
    12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
    13)PBS洗3次各5分钟;
    14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;
    15)PBS或自来水冲洗10分钟;
    16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;
    17)自来水冲洗10~15分钟;
    18)脱水、透明、封片、镜检。 
    SABC法
    1)脱蜡、水化。
    2)PBS洗两次各5分钟。
    3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。
    4)抗原修复。
    5)PBS洗5分钟。
    6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
    7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
    8)PBS洗三次每次2分钟。
    9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。
    10)PBC洗3次每次2分钟。
    11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。
    12)PBS洗4次每次5分钟。
    13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
    14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 
    15)脱水、透明、封片、镜检。 

 

上海康朗生物科技有限公司主营:Elisa试剂盒,人Elisa试剂盒,大鼠Elisa试剂盒,小鼠Elisa试剂盒,猪Elisa试剂盒,细胞,生物细胞学等科研产品
上海康朗生物科技有限公司 版权所有 总访问量:172137 地址:www.shklsw.com 邮编:201612
电话:86-021-61998208 传真: 手机:18217752821 联系人:蔡盼盼 邮箱:shklbio@163.com
GoogleSitemap 网址:www.shklsw.com 技术支持:化工仪器网 管理登陆 ICP备案号:沪ICP备15039594号-1
电话
021-61998208
手机
18217752821
点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息 点击这里给我发消息
分享到:

化工仪器网

推荐收藏该企业网站