TRIzol伴侣使用手册

产品及特点

TRIzol是美国Invitrogen公司的、用于总RNA提取（主要是动物总 RNA提取）的产品，具有广大的客户群。但其缺点之一是一直没有柱式 升级产品，客户仍然要使用既繁琐又费事的非柱式操作（另一缺点是不能用于 富含多糖和多酚的材料））为解决此问题，我们特推出本产品，主要特点是：跟TRIzol结合使用，把经典操作变成了柱式操作，简化了实验流程，用户可 以节约 30 分钟的时间。其他特点如下:

• RNA质量更好，因为操作简短减少了 RNA 在提取过程中的降解。
• RNA纯度更高，OD260/OD280 一般在 1.9 以上，比经典 TRIzol 法得到的更纯。
• 专门的洗涤条件能有效去除基因组 DNA，进一步减少其对 RNA 的污染。
• 适用于其他基于酸酚/ 异硫氰酸胍提取原理的RNA提取产品, 包括TRIzol、TRIzol LS、TRI Reagent 等。
• 可以省略氯处理步骤，避免接触有毒试剂（但效果稍差））。

规格及成分

运输及保存

常温运输和保存，有效期一年。

自备试剂

TRIzol 或 TRIzol 同类产品、氯

使用方法

• 按 TRIzol 的使用手册进行总 RNA 提取到加氯之前一步。
• 如果需要加氯，则继续按TRIzol的使用手册操作，用氯处理裂解液离心后得到上清液。如果省略氯处理步骤，则需要将裂解物直接离心。
• 将经过氯处理得到的上清液或没有经过氯处理直接离心得到的裂解液转移至一个干净的 1.5 mL 塑料离心管中。注意：如果是经过氯处理，则离心后，下层有机相和中间层将含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和 DNA 污染。为保险起见，可以留下100 μL上清液不取。同时吸取上清时缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
• 加入等体积的柱式动物RNAout溶液B，颠倒混匀 30 秒。
• 根据混合物的多少，一次或分两次转移到离心吸附柱中。
• 每次转移后，需要13000-15000 g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
• 加0.7 mL通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品OD260/280比值不高，可以再用0.3 mL通用洗柱液重复此步一次。
• 室温离心半分钟。此步对去除残留通用洗柱液十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的质量和使用。
• 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入50-100 μL RNA洗脱液。
• 室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
• RNA完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。
• RNA产量产率测定：将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中（pH 7.5-8.2 之间）检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量（浓度 X 体积）和产率（RNA产量/组织用量）。
• RNA纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1 之间（具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关），高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

疑难解答

Q：上样孔里的红色荧光物一定是DNA污染吗？

A：不是。用TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳RNA时容易产生此现象，天泽基因初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE作电泳液的话）形成的复合物，加RNase处理后，这些红色荧光物（RNA）一般会消失。为避免此现象，建议使用甲醛变性胶电泳和RNA上样液（如天泽基因的 RNAon）。

Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？

A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase处理RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用天泽基因的非酶的 DNA去除剂DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有残留的RNase污染，所以必须严格按照厂家提供的手册进行操作。