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即用型荧光PCR试剂盒使用手册
点击次数:535 发布时间:2017-10-16

即用型荧光PCR试剂盒

Instant Fluorescent PCR Kit

产品及特点

本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒,可以对基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列进行实时定量PCR分析(quantitative PCR、qPCR)。本产品含有经过优化的缓冲液组分、优化的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I和稳定剂等成分本产品中优化的Taq DNA Polymerase高温加热前,抗Taq 单克隆抗体与Taq结合,抑制Taq聚合酶活性,从而抑制在低温条件下出现的由引物和模板DNA之间的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增。而且抗体在PCR反应的预变性步骤中完全失活,不会阻碍之后Taq DNA聚合酶的活性,大大提高了 PCR 反应的灵敏度及特异性。

  • 方便,用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量PCR实验HRM(High Resolution DNA Melt Curve Analysis)分析而基于SYBR Green I和LC Green染料的qPCR mix则不能同时用于上述两种实验。
  • 使用抗Taq抗体封闭的优化的Taq DNA聚合酶,可抑制低温条件下的非特异性扩增。
  • 使用第三代饱和型荧光染料,信号强,不会抑制PCR反应。
  • 快捷,即用型的预配液使加样操作步骤大大简化,避免了交叉污染,降低实验误差。
  • 各成分的浓度和比例都经过精心优化反应的灵敏度高特异性强。能检测到浓度为50拷贝/mL的靶分子。

规格及成分

成 份

编 号

1 mL包装

6 mL包装

qPCR MagicMix,2×

90408

1 mL

6 mL

使用手册

1份

 

运输及保存

低温运输,-20℃保存, 保存期限为6个月。

自备试剂

DNA模板、引物、超纯水

使用方法

  • 20 uL的qPCR反应体系为例在一干净的PCR管中加入下列成分

反应体系成分

20 uL体系

终浓度

qPCR MagicMix,2×

10 uL

自备引物一a

x uL

0.1-0.5 uM

自备引物二a

x uL

0.1-0.5 uM

自备模板a

x uL

 

自备ROXb

2 uL

(可以不加)

超纯

20 uL

 

放入荧光PCR仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。

注意:

  • 通常引物浓度以0.2 μM可得到较好结果,可以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考;通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定*的模板使用量。
  • ROX 校正染料:如果使用ABI公司的7500,7700和7900三种型号的荧光PCR仪器,则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900,ROX的*浓度为1×(即在每20 uL 反应体系中加2 uL 10×ROX)。对ABI 7500, ROX的*浓度为0.05-0.1×(每20 uL 反应体系加0.1-0.2 uL 10×ROX;也可将10×ROX稀释到1×,然后每个反应体系加入1-2 uL 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音,因此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾,然后重新分析数据。

对于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000,RotorGene 6000  LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器,ROX不是必须的,但加入的话也不会影响整个PCR分析。

  • 循环步骤:根据扩增子的性质和仪器性能,从以下三个过程中任选一个进行扩增。

A:两步快速循环法:适用于引物Tm值设计为60℃的反应

循环步骤

温度

时间

循环数

酶活化

95℃

10 min

1

变性

退火&延伸

95℃

60℃

15 s

1 min

35-40

注意:本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考,发生非特异性反应时,可提高退火温度。

B:三步快速循环法:适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR(长引物PCR)

循环步骤

温度

时间

循环数

酶活化

95℃

10 min

1

变性

退火

延伸

95℃

56-64℃d

72℃e

10 s*

30 s

32 s

35-40

注意:

  • 退火温度:建议采用两步法PCR,退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性,可提高退火温度,以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原 因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法PCR扩增,三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度:延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是,对于AT含量大于70%的扩增子来说,延伸温度设为60℃为宜。

C:通用循环法:这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪,也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

循环步骤

温度

时间

循环数

酶活化

95℃

10 min

1

变性

退火&延伸

95℃

60℃

15 s

60 s

35-40

 

  • 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时,zui大吸收光谱在471nm,结合DNA时的zui大吸收光谱在500nm,zui大发射光谱在530nm。

 

其他注意事项:

  • 如果使用iCycler,可以不加入FAM。
  • 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR,需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。

关联产品

即用型PCR2.0、PCR级绿如蓝染料


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