- 以20 uL的qPCR反应体系为例:在一干净的PCR管中,加入下列成分:
反应体系成分 | 20 uL体系 | 终浓度 | qPCR MagicMix,2× | 10 uL | 1× | 自备引物一a | x uL | 0.1-0.5 uM | 自备引物二a | x uL | 0.1-0.5 uM | 自备模板a | x uL | | 自备ROXb | 2 uL | (可以不加) | 补超纯水到 | 20 uL | |
放入荧光PCR仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。 注意: - 通常引物浓度以0.2 μM可得到较好结果,可以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考;通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定*的模板使用量。
- ROX 校正染料:如果使用ABI公司的7500,7700和7900三种型号的荧光PCR仪器,则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900,ROX的*浓度为1×(即在每20 uL 反应体系中加2 uL 10×ROX)。对ABI 7500, ROX的*浓度为0.05-0.1×(每20 uL 反应体系加0.1-0.2 uL 10×ROX;也可将10×ROX稀释到1×,然后每个反应体系加入1-2 uL 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音,因此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾,然后重新分析数据。
对于iCycler IQ,MJ Opticon,MJ Chromo4,MX3000,MX4000, RotorGene3000,RotorGene 6000 和 LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器,ROX不是必须的,但加入的话也不会影响整个PCR分析。 - 循环步骤:根据扩增子的性质和仪器性能,从以下三个过程中任选一个进行扩增。
A:两步快速循环法:适用于引物Tm值设计为60℃的反应 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 酶活化 | 95℃ | 10 min | 1 | 变性 退火&延伸 | 95℃ 60℃ | 15 s 1 min | 35-40 |
注意:本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考,发生非特异性反应时,可提高退火温度。 B:三步快速循环法:适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR(长引物PCR) 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 酶活化 | 95℃ | 10 min | 1 | 变性 退火 延伸 | 95℃ 56-64℃d 72℃e | 10 s* 30 s 32 s | 35-40 |
注意: - 退火温度:建议采用两步法PCR,退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性,可提高退火温度,以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原 因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法PCR扩增,三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度:延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是,对于AT含量大于70%的扩增子来说,延伸温度设为60℃为宜。
C:通用循环法:这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪,也适用于用快速循环法不能扩增的模版。 循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 酶活化 | 95℃ | 10 min | 1 | 变性 退火&延伸 | 95℃ 60℃ | 15 s 60 s | 35-40 |
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时,zui大吸收光谱在471nm,结合DNA时的zui大吸收光谱在500nm,zui大发射光谱在530nm。 其他注意事项: - 如果使用iCycler,可以不加入FAM。
- 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR,需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。
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