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冷冻干燥中的保护剂
点击次数:4012 发布时间:2017-07-07
 

冷冻干燥中的保护剂

冷冻干燥简称冻干是将需要干燥的药物溶液预先冻结成固体然后在低温低压条件下从冻结状态不经过液 态而直接升华除去水分的一种干燥方法由于整个操作过程都处于低温状态故这种方法尤其适用于热敏性蛋白质药物制剂的制备。而冻干后的蛋白质药物呈疏松状饼块样,不仅有利于保存而且有利于蛋白质药物重溶后的复性。显然,冻干技术为理化性质不稳定的蛋白质药物制剂提供了一种有效的制备方法然而冻干过程是一个复杂的相变过程,在冻结、冻融、干燥和储存过程中存在着多种诱导药品中蛋白质变性的因素,故常需使用一些保护剂来稳定处方中的蛋白质。冻干保护剂的种类繁多,机制复杂,为了对此有更深入细致的了解,更为合理的使用这些辅料及制备出高质量的冻干产品,本文就近年来国内外学者对蛋白质冻干制品保护剂作一综述。

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冻干制品的整个冻干过程存在着各种各样的应力,通常包括低温应力、冻结应力(包括枝状冰晶的形成、离子强度的增加、PH值的改变、相分离等)、干燥应力(移去蛋白质表面单层水分子)等,这些应力常常是直接或间接导致蛋白质药物不稳定的因素。根据保护剂对抗应力的不同可把蛋白质保护剂初步分为冷冻保护剂和冻干保护剂。一个优良的蛋白质保护剂不仅能够在整个冻干过程中对蛋白质药物起到良好的保护作用,而且能够对成品贮藏期内蛋白质药物的变性起到抑制作用,因为蛋白质药物在贮藏期的变性率往往比在冻干过程中的变性率要大,然而,多数在溶液中很有效的蛋白质冷冻保护剂种类对干燥态的蛋白质并无保护作用,甚至还会加速蛋白质药物的不稳定化,例如,在PH5的10mmol/L醋酸钠溶液中,加入CaCl2能能够提高胰肤酶的稳定性,但同时会增加蛋白质冻干饼块的塌陷及蛋白质活性的丢失。而在干燥过程中对蛋白质起保护作用的保护剂也可能对冷冻状态下的蛋白质起不到任何保护效果,为了扩大保护作用,常常需要在冻干制品中使用两种类型以上的保护剂常用的保护剂种类有多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基酸、盐、胺、表面活性剂等。

 

1、多羟基化合物

多羟基化合物用作蛋白质的抗冻剂由来已久,常见的该类冻干保护剂有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可促进冻干处理的过氧化氢酶复性,且随着甘油浓度上升至0.8%时过氧化氢酶能完全复性。甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用,而且在一些处方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关,而其浓度与结晶形态有时呈一定的关联性。通常认为无定型甘露醇具有使蛋白质稳定的作用而结晶态的甘露醇则失去保护功能;1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集,但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。

 

2、糖

糖是zui常见、使用zui广的一类冻干保护剂,是蛋白质的非特异性稳定剂,在冻干的各个阶段(如冷冻、冻融及升华干燥等)均能对蛋白质药物起到一定的保护作用。糖的保护作用与其及蛋白质的种类有关,而双糖是研究zui多也公认zui有效的保护剂,其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所构成的双糖,化学性质稳定,多呈无定型结构,对阻止蛋白质二级结构改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。与蔗糖相比,海藻糖具有更高的玻璃化温度、更低的引湿性、更不具有还原性,这些优点均预示着海藻糖可能具有更广阔的应用前景。大分子糖对蛋白质提供的保护作用似乎不及小分子糖 诸多的研究均显示分子量大的多糖不是冻干保护剂的*选择。但有些研究结果却与此相反,如对大分子量菊糖的研究表明聚合度高于5.5-6.0的的菊糖对碱性磷酸酶的活性保护作用明显高于海藻糖及低聚合度的菊糖。这说明对多糖的保护作用不能一概而论。特别是在储藏期,右旋糖酐等多糖可提高制品的玻璃化温度,阻止因制品塌陷而诱导蛋白质破坏。葡萄糖在冻干过程中可部分保持无定型,对某些蛋白质药物具有一定的保护作用,但应该注意的是葡萄糖系还原性糖在选其作为蛋白质的保护剂时要慎重。糖对蛋白质保护作用大小有时依赖于其浓度,通常在某个浓度范围内糖的保护作用随着浓度的升高而增大;当达到某一浓度时保护作用达到zui大值,而此后再增大糖的浓度则保护效果不再显著增加,有时反而会降低。对呈现zui大保护作用时糖的浓度其报道不一,如100mmol/L蔗糖对B-半乳糖配酶的保护效果,而对磷酸果糖激酶提供zui大保护作用的海藻糖浓度为300mg/ml,文献报道糖获得zui大稳定作用的zui低浓度是其足够在蛋白质表面形成一个单分子层的浓度,实际上,糖对蛋白质的保护作用不仅取决于糖的总体浓度而且还与两者的比例有关,有人研究发现a-D-吡喃甘露糖乳糖、海藻糖、纤维二糖等与重组人生长激素的摩尔比为131:1时它们均能100%地占据重组人生长激素上强及弱的水结合位点,对其提供*的保护效果,当摩尔比达300:1及1000:1时糖对重组人生长激素的保护作用不再提高且在某些处方中保护作用甚至会有所下降。

糖的还原性及其它性质(如旋光性)也会影响其对蛋白质的保护作用。葡萄糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖等还原性糖均有可能与蛋白质上暴露的某些氨基酸残基发生迈拉德反应(即拨氨反应或棕色反应),使制品变黄和蛋白质活性降低,旋光性不同的麦芽糖糊精在冻干过程中对乳酸脱氢酶的保护作用显示出很大差异。

目前用作蛋白质保护剂的糖有葡萄糖、a-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、麦芽糖、肌糖、棉白糖、菊糖、右旋糖酐、麦芽糖糊精、麦芽多糖、八硫酸蔗糖、肝素、2-羟丙基-B环糊精等。尽管糖能够对多数蛋白质提供可靠的保护作用,但并非所有的蛋白质都能被糖所保护,这仍有待于更为细致深入的研究。

 

3、氨基酸

氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一,在冷冻过程中低浓度的甘氨酸可通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶所致PH值的改变而阻止蛋白质药物变性。无定型甘氨酸可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集;结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏常用的氨基酸类蛋白质保护剂有脯氨酸、色氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

 

4、聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、聚乙烯亚胺等聚合物也常用作为蛋白质的冷冻保护剂。通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质,如优先从蛋白质表面析出、表面活性、使蛋白质溶液黏度升高从而阻止其他小分子(如糖及多轻基化合物)的结晶、抑制冷冻过程中PH值的剧烈变化等。不同聚合度及浓度的聚合物所提供的保护作用不同,如聚合度大的PVP有着较高的玻璃化温度,随着PVP浓度及分子量增加,水溶液的黏度随之变大,蔗糖的玻璃化温度明显升高,对冷冻过程中的蛋白质所起的保护作用随之也有所增加;但聚合度过大时,聚合物会在冷冻过程中结晶,从而失去对蛋白质的保护作用,而且浓度及分子量过大时会增加zui终产品的水分,使得制品中蛋白质变得更不稳定。右旋糖酐40对猪的胰蛋白酶稳定作用比右旋糖酐80强,提示聚合物合适的链长有利于胰蛋白酶的稳定。

 

5、蛋白质

蛋白质类保护剂可分为两种:一种是蛋白质药物自身,另一种为外来蛋白质。一些蛋白质经冻融后的活性直接和蛋白质的起始浓度有关,起始浓度升高有时会促进蛋白质的复性。一种常用的外来蛋白质类保护剂为血清白蛋白,它是一个经典、优良的蛋白质稳定剂。例如,冷冻时1% 牛血清白蛋白可使兔肌肉乳酸脱氢酶水溶液的活性不受损失;人血清白蛋白则在更低浓度(0.05%-0.1%)时也能有效阻止蛋白质表面的吸附,对冻干过程中多数蛋白都具有保护作用,因而常用于白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等疏水性细胞因子冻干处方中。然而,由于血清白蛋白潜在的血源性病原体污染限制了其在蛋白产品中的应用。已有人把重组人白蛋白推荐为血清白蛋白的替代品。

 

6、其它

吐温80、布里杰、普朗尼克及十二烷基磺酸钠等一些表面活性剂有时对冷冻及干燥过程中的蛋白质起到一定的保护作用。在某些冻干制品中,加入盐和胺可获得特定的蛋白质稳定化效果。联合使用不同类型的保护剂可获得稳定性更佳的冻干制品。

如何获得稳定的蛋白质冻干制品,选择适宜的保护剂至关重要。那么如何去选择适宜的保护剂呢?首先要对被保护的蛋白质药物理化特性有一个充分的了解,继而再通过试验摸索出在冻干过程及贮藏过程中导致该蛋白质药物不稳定的因素,然后针对这些不稳定因素选择具体的保护剂一般而言,糖及多羟基化合物是zui常用的冻干保护剂,其中蔗糖 海藻糖等双糖对一些蛋白质均能显示出良好的保护作用,故在选择冻干保护剂时应优先考虑。一个优良的冻干保护剂应该具备多种保护特性,如高的玻璃化温度 低的吸湿性能 低的结晶速率 及不具有还原性基团等。但任何单一保护剂都不可能具有所有的保护特性,因此有时还得考虑使用2种或2种以上的保护剂来稳定蛋白质药物。

 

结 语

随着生物技术的飞速发展,越来越多的蛋白质药物被开发出来。截至目前为止除了采用冻干技术外尚无更有效的制剂手段可用来制备较为稳定的蛋白质产品,即便采用冻干技术制备某些蛋白质产品仍需要采取一些有效的辅助手段,如加入冻干保护剂以增加蛋白质的稳定性。近些年来冻干保护剂及其保护机制研究更加深入。特别是蛋白质分析手段的提高为蛋白质保护剂的研究提供了方便,计算机技术在冻干过程中的应用使得能够建立相应的数学模型对冻干过程中物料的真实状态进行模拟解析,从而也使得冻干技术得以完善与提高。但蛋白质的稳定机制相当复杂,对蛋白质冻干制品的研究有待进一步的深化。开发更优越的冻干保护剂,提高蛋白质药物冻干制品的质量仍是现今生物技术药物研究的重点与方向。

 

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