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ELISA样本制备及注意事项
点击次数:823 发布时间:2016-11-03
 

ELISA样本制备及注意事项

ELISA样本制备及注意事项

一、血清的采集、处理和保存

1、真空采血针采集新鲜血液,加入无菌试管中;

2、采血后室温静置1小时;

3、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min;

4、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

5、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。

二、ELISA 实验中血浆的采集、处理和保存

1、真空采血针采集2ml 新鲜血液,加入无菌试管中;

2、按 1:9加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠),30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染;(也可以直接用抗凝管采集);

3、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心5min;

4、取上清。分装冻存备用,

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

5、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求,建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。

三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存

1、采集尿液样本500ul,加入无菌试管中;

2、将采集血液用离心机4℃,2500rpm离心10min;

3、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA测定。

四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存

1、采集脑脊液样本,加入无菌试管中;

2、将采集的脑脊液用离心机4℃,2500rpm 离心10min;

3、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-80℃下,可放置保存6个月;

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存

1、采集细胞培养上清液,加入无菌试管中;

2、将采集的细胞上清液用离心机4℃,2500rpm离心10min;

3、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

4、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

六、ELISA 实验中肺泡灌洗液的采集、处理和保存

1、10%水合氯醛溶液,腹腔麻醉;

2、打开腹腔,另取10ml注射器行下腔静脉采血,尽可能将血放尽;

3、在冰面上对左肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5ml,分三次灌洗:2ml、1.5ml、1.5ml灌,。回收率在70%以上;

4、将采集的肺泡灌洗液用离心机4℃,2500rpm离心10min;

5、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

七、ELISA 实验中关节滑液的采集、处理和保存

1、口腔关节:患者取坐位,常规消毒后,作皮下及关节后区局部浸润麻醉。然后嘱患者大张口,采用装有2ml生理盐水的注射器(5号针头)作关节上腔穿刺,髁后进针,针尖方向斜向前、内、上,抵达关节结节后斜面后稍后退,回抽如发现有淡黄色液体,即表明已进入关节上腔,注入2ml生理盐水,反复注入、回抽五次;

2、膝骨关节滑液:无菌穿刺取得关节液3ml;

3、将采集的关节滑液用离心机4℃,1500rpm离心15min;

4、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

5、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

八、ELISA 实验中细胞的采集、处理和保存

1、细胞板贴壁细胞直接裂解:细胞弃培养上清,PBS清洗三遍,加适量裂解液重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打100下;

2、细胞团块裂解:细胞团块加1ml PBS重悬(注意不要过于剧烈造成细胞破裂),1000rpm离心5分钟,弃上清,重复3次,加适量裂解液重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打100下;

3、悬浮细胞裂解:转移至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,PBS洗三遍,加适量裂解液重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打100下;

4、冰上裂解30mins,用离心机4℃,12000rpm离心10mins;

5、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

根据要检测的指标,必要时需要加入蛋白酶抑制剂。如果处理后马上检测,也可以不加这些抑制剂直接裂解,裂解液的量根据不同细胞系会有不同,原则为裂解后总蛋白浓度不低于0.5mg/ml。

九、ELISA 实验中易碎软组织(脑、肝、肾)的采集、处理和保存

1、称取组织块(50mg-100mg),按质量体积比1:9加入裂解液(例:50mg组织湿重加入450ul裂解液);

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;

3、冰水浴中电动匀浆机或超声破碎;

4、用离心机4℃,12000rpm离心15mins;

5、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

根据要检测的指标,必要时需要加入蛋白酶抑制剂。如果处理后马上检测,也可以不加这些抑制剂直接裂解。

十、ELISA 实验中心肌、肌肉组织的采集、处理和保存

1、称取组织块(50mg-100mg),按质量体积比1:9加入裂解液(例:50mg组织湿重加入450ul裂解液);

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;

4、用离心机4℃,12000rpm离心15mins;

5、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆,组织块会绞入钻头形成团块,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎。根据要检测的指标,必要时需要加入蛋白酶抑制剂。如果处理后马上检测,也可以不加这些抑制剂直接裂解。

十一、ELISA 实验中上皮组织(皮肤、膀胱、肠)及人或大鼠眼角膜的采集、处理和保存

1、称取组织块(50mg-100mg),按质量体积比1:9加入裂解液(例:50mg组织湿重加入450ul裂解液);

2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;

4、用离心机4℃,12000rpm离心15mins;

5、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

上皮组织韧性较强,较难剪碎,需要增加组织破碎时间才能充分破碎。根据要检测的指标,必要时需要加入蛋白酶抑制剂。如果处理后马上检测,也可以不加这些抑制剂直接裂解。

十二、ELISA 实验中小颗粒组织(神经节、小鼠眼角膜、巩膜)的采集、处理和保存

1、加入200ul裂解液;

2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块;

3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;

4、用离心机4℃,12000rpm离心15mins;

5、取上清。分装冻存备用:

2-8℃下,可放置保存24-48小时;

-20℃下,可放置保存1个月;

-70℃下,可放置保存6个月;

6、根据你的实验需要,取适量上清夜进行各种ELISA 测定。

小颗粒组织量比较小,会有靶标蛋白量低于检测限度的风险,注意组织匀浆离心后上清总蛋白浓度需大于0.5mg/ml。根据要检测的指标,必要时需要加入蛋白酶抑制剂。如果处理后马上检测,也可以不加这些抑制剂直接裂解。

 

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