原代细胞冻存是生物医学研究中的关键技术

　　原代细胞冻存是生物医学研究中保存细胞资源、维持细胞特性的关键技术，其核心在于通过合理操作减少冰晶形成对细胞的损伤，确保复苏后细胞活性和功能。
 

　　一、冻存前准备
 

　　1.细胞准备
 

　　-选择处于对数生长期的原代细胞，此时细胞活性高、增殖能力强，冻存后复苏效果好。
 

　　-冻存前1-2天更换新鲜培养基，确保细胞状态良好，汇合度控制在70%-80%为宜。
 

　　2.试剂与耗材准备
 

　　-冻存液：常用配方为胎牛血清(FBS)80%+培养基10%+二甲基亚砜(DMSO)10%。DMSO为冻存保护剂，需提前4℃预冷；FBS需选择优质胎牛血清，提供营养支持。
 

　　-耗材：无菌冻存管(提前标记细胞名称、冻存日期、代数)、离心管、移液管、离心机、超净工作台。
 

　　-设备：程序降温盒(或异丙醇降温盒)、-80℃冰箱、液氮罐。

 

　　二、原代细胞冻存步骤
 

　　1.细胞收集
 

　　-吸弃培养皿中的旧培养基，用无菌PBS轻柔冲洗细胞表面2次，去除残留血清。
 

　　-加入适量胰蛋白酶(根据细胞类型调整浓度，通常为0.25%)，37℃孵育1-3分钟，倒置显微镜下观察，待细胞间隙增大、变圆脱落时，立即加入含血清的培养基终止消化。
 

　　-用移液管轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，收集至离心管中。
 

　　2.离心洗涤
 

　　-以1000-1500rpm的转速离心5-8分钟，弃上清液，得到细胞沉淀。
 

　　-向细胞沉淀中加入少量预冷的冻存液，轻柔吹打重悬细胞，避免产生气泡损伤细胞。
 

　　3. 细胞计数与分装
 

　　- 取少量细胞悬液进行计数，调整细胞浓度至1×10⁶ - 5×10⁶ cells/mL。
 

　　- 将调整好浓度的细胞悬液分装至冻存管中，每管1-2mL，旋紧冻存管盖，确保密封。
 

　　4.缓慢降温
 

　　-将冻存管放入程序降温盒(内加异丙醇，提前4℃预冷)，直接放入-80℃冰箱，实现1℃/min的缓慢降温，静置12-24小时。
 

　　-若没有程序降温盒，可将冻存管先置于4℃冰箱30分钟，再移至-20℃冰箱1-2小时，最后转入-80℃冰箱过夜，模拟缓慢降温过程(该方法效果略逊于程序降温盒)。
 

　　5.长期保存
 

　　-从-80℃冰箱取出冻存管，迅速放入液氮罐的气相区长期保存，避免在室温下暴露时间过长。
 

　　三、原代细胞冻存中的关键注意事项
 

　　1.DMSO相关
 

　　-DMSO对细胞有一定毒性，需在4℃预冷，且细胞在冻存液中停留时间不宜过长，分装后尽快进入降温程序。
 

　　-操作时需在通风橱内进行，避免吸入DMSO挥发气体。
 

　　2.无菌操作
 

　　-全程在超净工作台内无菌操作，所有试剂和耗材需灭菌处理，防止细胞污染，尤其原代细胞对污染更为敏感。
 

　　3.降温速率
 

　　-缓慢降温是冻存成功的关键，过快会导致细胞内形成大量冰晶，破坏细胞膜和细胞器；过慢则可能导致细胞脱水损伤。
 

　　4.标记清晰
 

　　-冻存管必须清晰标记细胞信息，液氮罐中需分区存放，做好记录，避免混淆。