猪戊型肝炎间接ELISA诊断试剂盒的研制

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染引起的一种急性、自限性疾病。病毒通过粪-口途径进行传播,其爆发和流行主要分布在发展中国家,常因饮用水被污染而引起,散发病 例呈分布。1997年,*株动物源性HEV—猪HEV的发现,揭开了动物源性HEV研究的新篇章。其后,各发达国家及印度等国陆续都有猪HEV的相 关报道,明确提出HE为一种人畜共患病,已成为各国密切关注的公共卫生问题。 本试验应用RT-PCR技术从HEV阳性猪粪便中扩增出ORF2的部分基因片断,大小为681bp,将其克隆于pMD18-T载体经测序分析。将该片段插 入pET-32a表达载体,转入大肠杆菌BL21,经0.2mM IPTG诱导得到融合表达蛋白,SDS-PAGE分析证明该分子量为45KD,命名为PET32a-p221。Western blot试验显示PET32a-p221与HEV阳性血清发生反应,具有良好的抗原性。应用PET32a-p221作为抗原,确定了zui适包被浓度为 6μg/mL,血清zui适稀释度为1:100,作用时间为60min,酶标抗体zui适稀释度为1:4000,作用时间为60min,建立了HEV间接 ELISA诊断方法。该方法与猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清不发生交叉反 应,具有良好的特异性。批内重复试验变异系数小于10%,批间重复试验变异系数小于15%,说明具有很好的重复性。用该方法检测青海省人畜血清样品结果显 示,HEV感染率有显著差异(x~2=38.78,P＜0.01),其中以猪感染率zui高为95.96%,其次家犬感染率为30%,在马和鸡中未检出戊型肝 炎。同一种动物HEV感染率在不同地区差异不显著(x~2=5.78,P＞0.05)。该方法与万泰公司双抗原夹心ELISA诊断试剂在检测人、马、鸡、 牛、猪戊型肝炎的符合率均为100%,而在家犬和山羊的符合率上存在差异,但不显著。 本试验建立的猪戊型肝炎间接ELISA诊断方法通过实验室和现地应用,表明该方法具有良好的特异性、敏感性,为我国猪戊型肝炎的防治与监测提供了诊断技 术。