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qPCR结果都不一样?这些技巧你需要掌握!
点击次数:553 更新时间:2023-10-27

简介

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)也称 QPCR,是指在DNA 扩增应中,以荧光化学物质测单次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法

原理与操作 

QPCR 技术实现了 PCR 从定性到定量的飞跃,以特异性强、重复性好、定量准确、可实时监测等优点成为了分子生子生物学研究中常用工具。


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QPCR 自1983年发明以来,经过数次更新迭代,到如今在实验中广泛运用,

做过qPCR(荧光定量PCR)的小伙伴,可能会遇到这样的问题,明明已经按照文献的方法,照搬PCR引物,可还是每次结果都不一样。

其实原因有这么几个:

一、操作原因,你可能不太会用移液枪

有些小伙伴可能会说,移液枪使用多么简单,怎么可能不会用?实际上,在使用移液枪,特别是微量移液枪的时候,我们往往会长期快速操作,也就是说在弹簧还没来得及恢复的时候,我们已经又按了一下了。这样可能导致的结果不用我多说,首先可能会导致……指关节受伤。当然,这些只是其次,最重要的是会影响移液量。

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所以,关爱拇指,吸取液体时,保持1-2秒,给弹簧一个缓冲。当然,在加模板的时候,提高模板加样量,也可以尽可能减少每次加样的误差。

吸取液体的时候,需要把枪头插入凹液面底部,而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡:

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当然,你会说,每次枪头都插很深(莫名其妙觉得是在开车),但是这样的话,就很容易在枪头上沾上液滴,在微量的模板加样时,很容易导致加样量的误差。

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二、RNA的降解,也就是RNA完整性的问题  

RNA的完整性,一般体现在电泳过程中18S和28S的亮度上,如果这两个条带的RNA亮度变低,甚至没有,就说明RNA的完整性应该会有损失。(但实际上现在没人去跑电泳)导致RNA完整性受损的原因有很多,比如:

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包括镁离子,pH,温度,紫外线,福尔马林等等都会对你的RNA产生影响。所以,要处处小心。于是有人做了这样的实验,就是对于RNA的降解,有没有什么方法可以降低RNA降解对于qPCR的影响。

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他们分别分析了3`端和5`端的扩增CT值,以及长片段和短片段的ΔCT,发现RNA的完整性缺失与3`端和5`端没多大关系,但是短片段会比长片段扩增效率更高。所以,qPCR引物设计的过程中,尽量把片段设计得短一点。

三、抑制物,这点相对难解决               

在反转录过程中或者PCR过程中都可能有抑制物,这些抑制物,比如Na离子,EDTA,SDS,酚,血红素,腐植酸等等,都会对qPCR结果产生影响。具体体现在扩增曲线里会是这样:

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实际上去除抑制剂也只能在抽提的过程中尽量洗脱掉抑制剂,别的操作过程中其实也没什么办法(加促进剂可能又会产生不稳定因素)。

我们往往谨慎对待:引物、探针、Ct 值等,但也有一些小东西会被忽视,比如:ROX™。也许很多同学的第一反应是:总听人说起 ROX™,但它是什么?它在荧光定量 PCR 里起到什么作用呢?

其实和 FAM™、VIC™、SYBR™ Green 类似,ROX™ 也是一种在 qPCR 反应中能被 qPCR 仪检测到的荧光染料分子。但与其他染料不同,ROX™ 是一种惰性参比染料,也就是说,其荧光信号并不随着 PCR 扩增而增强。相反,ROX™ 的荧光信号值在反应中是基本保持不变的。

四、ROXTM  有什么问呢?             

其实,在 qPCR 反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测,从而造成孔间数据的差异。例如:PCR 反应板本底信号不均一,PCR 管盖厚度有差异,同一反应体系在分装时出现了差异等因素。ROX™ 能帮助我们通过均一化校正消除这些因素的误差,从而提高数据精确性。

五、ROXTM  的工作原理?             

请大家注意看板上的两个孔,我们在每个孔中加入「wan全等量」的样本,然后进行扩增。很快,30 个循环完成了。在每一个循环中,我们的仪器都会读取出一个荧光信号值。

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理论上仪器检测出这两个孔的信号值应该是wan全相同的,因为刚开始的时候样品是wan全一样的。但实际上,由于移液器加样存在误差,耗材孔间不同等一系列差异,这两孔检测出的信号值并不相同。幸运的是,我们在两个孔中都加了相同的 ROX™,而我们的仪器也同时读取了 ROX™ 的信号值。

可以看到,ROX™ 信号和 qPCR 反应荧光信号都有差异。仔细思考大家会发现,反应本身的这些物理差异会对 ROX™ 信号和 qPCR 反应的荧光信号造成同等程度的影响。

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重要的是,我们的仪器会在每一个循环中检测每一个反应孔的这两种信号,然后在反应结束后自动进行均一化处理。结合仪器自身的一系列荧光校准参数,最终您的数据精度会得到显著提高。顺便提一下,最终这个值也就是我们所说的 Rn 值,也表示报告基团的标准化荧光值。

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六、两个关于ROXTM  的重点:          

第一,除非有些特殊情况,Applied Biosystems™ 提供给您的荧光定量预混液已经包含了最佳浓度的 ROX™,因此您无需再额外添加。

第二,所有 Applied Biosystems™ 实时荧光定量 PCR 软件是默认检测 ROX™ 并使用均一化数据,这会帮您提高数据精确性。如果您选用的试剂盒或者预混液不含 ROX™,依据您对实验的精度的要求不同,您可以另外采购 ROX™ 摸索最佳浓度优化实验,您也可以将参比荧光染料选项改为 None(无),放弃 ROX 校正。在没有 ROX™ 存在的情况下,我们建议选择参比荧光为 None 进行数据分析。

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好了,看看你的操作过程中是不是有这样或者那样的问题,看看你的扩增曲线是不是有比较奇怪的变化,然后,进行改进吧。





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