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实验小白入门|PCR基础知识介绍
点击次数:118 发布时间:2021-08-31

本期讲堂,作为PCR基础知识的开篇,我们先来了解一下最基础的PCR原理、操作流程、成功的要素这三部分内容。


PCR作为一项基础的分子生物学技术,由于操作简便、省时、灵敏度高等优点,在生物科学研究领域应用广泛:从克隆、基因编辑、下一代测序(NGS)到基因分型、法医zhencha、病原鉴定等,都离不开PCR技术的助力分析。


首先我们先来了解一下PCR的原理,


一、PCR原理



PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。


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理论上,每一轮循环可使DNA的数量增加一倍,经过n次循环后,反应混合物中所含的DNA数量为2n。



二、PCR操作流程




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①DNA制备

从样品中提取PCR反应所需的DNA模板、直接PCR无需此步。
推荐商品化的核酸提取试剂,节省时间、简化操作流程、减少DNA提取量的损失。

②PCR反应

包括反应液的制备和PCR反应两个步骤。

反应液的制备
普通PCR的反应体系由DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板这五大要素组成。商品化的DNA聚合酶,一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应缓冲液,因此仅需我们准备引物及DNA模板,并且根据说明书推荐量进行反应液配制即可。

PCR反应
选择适宜的梯度PCR仪,根据扩增片段大小及酶制品说明书推荐来进行PCR反应条件设置。

③电泳、染色

PCR反应后,通过凝胶电泳确认扩增片段大小。

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三、PCR成功的要素

DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、4 种dNTP、引物及靶序列DNA模板是构成PCR反应组分的五大要素,这是影响PCR成功的内因;PCR反应条件的设置,是影响PCR成功的外因。


酶 

之前提到过商品化的DNA聚合酶,一般包含了适宜浓度的dNTP及最适反应buffer,因此酶的选择至关重要,我们需要兼顾保真性、扩增特异性、扩增速度、扩增效率、模板复杂程度及扩增片段长度等,选择最适PCR酶。


引物

引物是PCR特异性反应的关键,PCR反应引物的浓度一般在0.1μm~1μm之间,以zuidi引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。


模板

模板的完整性要好,模板降解会导致PCR扩增无产物。同时模板纯度也尽量越纯越好,纯度不好,可用PCI(苯酚氯仿抽提)及EtOH(乙醇沉淀 )精制。

模板添加量可以参考酶制品说明书及下表的建议模板量进行添加,加量过多会导致非特异性扩增产物增加:

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反应条件

PCR反应条件可以参考酶制品说明书及下表进行设置:

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四、常见问题


1.假阴性

不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及溴乙锭的使用, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。

2.阴性

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

3.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高

引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带:PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带:PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:减少酶量,或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量,减少循环次数。



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