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技术问题|抗体的常见问题和解答(一)
点击次数:144 发布时间:2021-08-10

提问&解答

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本期小编将分享抗体的常见问题和解答,

如果您经常对抗体有疑惑,推荐您持续关注


什么是抗体?


抗体(英语:antibody),(免疫球蛋白不仅仅只是抗体)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌,被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质,仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中,及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征,该外来目标被称为抗原。



多抗和单抗的区别?


多抗是多个B细胞克隆产生的针对多种抗原表位的多种抗体混合物,单抗是一个B细胞克隆产生的针对一种抗原表位的的单一抗体。




多抗较单抗的优势是什么?


a.制备成本低廉,制备所需技术要求不高,制备周期短。

b. 能识别一个抗原上的多个表位,可在IP等实验中获得更好的结果。

c. 多抗因为靶蛋白可在多个表位上结合不止一个抗体分子,有助于放大低表达水平的靶蛋白信号。

d. 能识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质,或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白,例如当未测试物种中的抗原性质未知时,有时会使用多克隆抗体。e. 可识别多个结构域,即使原始抗原的一些空间结构或者序列发生小变化或者部分抗原决定簇变化,仍可以识别抗原,因此有更大的适应性。



多抗较单抗的劣势是什么?


a.容易产生批次间的差异

b. 产生大量的非特异性抗体,有时可能在某些应用里产生背景信号。



单抗如何选择?


如果对抗体的特异性要求高,用量较大或需要长期使用一致的抗体,制备的抗体应用要求多(WB/IP/IF/ICC等),可以选择制备单克隆抗体。




多抗如何选择?


多抗相比较单抗仍然有制备时间短、制备成本低的特点,在一些情况下也是一种选择。另外,在相同条件下,使用多抗可以提高检测的灵敏度,对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。




WB, IHC, IP/ChIP类型抗体有什么区别?


WB:目前最常做的类型,WB识别的蛋白是经过加热变性之后都变成线性结构的蛋白。

IHC:兔疫组化中需要进行固定一步, 固定是为了尽量让细胞的形态结构维持和原有的一致。这种化学物质的固定使蛋白

质变性凝固,与天然状态下的蛋白质有了一定的区别,但是又不同WB中加热变性变成了线性的结构。

IP/ChIP:这类实验是用抗体去结合生理状态下的蛋白质,因此IP和ChIP的抗体最好使用纯化的天然蛋白制作的抗体。



目的蛋白分子量为何与实际不符?


当条带所示的实际大小与理论有偏差时,可能有以下原因导致:蛋白发生如磷酸化、糖基化等翻译后修饰时条带会上移,蛋白发生剪切(如前体)时条带会下移,蛋白存在不同的可变剪切体或亚型,强相互作用大分子存在时变性不彻底。



多抗做WB检测为何有杂带?


a. 从纯化方式来看:采用ProteinA/G纯化的多抗掺杂有动物本身产生的对其自身抗原产生的抗体,这些抗体在检测中会识别样本中的蛋白而出现杂带,可以采用抗原亲和纯化避免杂带的产生。

b. 从蛋白修饰来看:天然蛋白存在复杂的翻译后修饰。这点可以通过信息学分析进行解释。

c.从蛋白翻译后加工来看:翻译后蛋白前体经切割可能会使部分蛋白分子量偏小,而天然组织中同时存在蛋白前体和切割加工后的蛋白,二者序列有相同部分,可能会产生杂带。这点需要通过查阅与目的蛋白相关文献进行了解。

d.从同源家族蛋白来看:当目的蛋白有同源家族蛋白时,蛋白异构体的存在可能会使分子量偏离预测分子量,因为天然样本中由同一个mRNA不同的剪接方式进行翻译形成的蛋白产物也会有相同的抗原表位,同时被抗体识别时会产生杂带。

e. 从蛋白聚集形式来看:蛋白多聚体的形成,虽然还原条件可以抑制多聚体的形成,但是强烈的蛋白间相互作用在还原条件下也有可能不解聚导致条带偏大。



抗体做WB为何不识别内源样本?


蛋白在天然样本中的丰度太低,此时需要进行富集或者过表达再进行检测。b. 如果丰度不低,单抗/多抗不识别内源可能是该抗体识别的表位在天然蛋白中有修饰位点,此时需要对蛋白进行修饰位点的分析。





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